发布日期：2026-06-09 11:26:17 氨基酸发酵行业正面临成本竞争与质量提升的双重压力，传统的离线取样检测方式存在滞后、污染风险高、信息量有限等局限。在线拉曼光谱技术作为一种分子振动光谱分析方法，能够实时获取发酵液中多种组分的“指纹”信息，配合化学计量学模型实现浓度定量检测。
氨基酸发酵是生物制造领域的重要组成部分。在全球生物制造产业持续扩大的背景下，发酵过程的精细化控制日益受到重视。我国作为生物发酵产能大国，氨基酸产量在全球市场中占有较大份额。发酵过程中，底物浓度的精准控制、代谢产物的实时监测，直接关系到产物得率与工艺效率。
传统发酵控制方式依赖于人工离线采样和实验室分析。操作人员定时从发酵罐中取出样品，送至分析室进行检测，再将结果反馈到生产现场。这一流程虽然能够获得较为准确的浓度数据，但存在明显的滞后性。发酵罐内的生化反应持续进行，而检测结果往往在几十分钟甚至数小时后才能返回，此时罐内状态已经发生变化，检测数据无法准确反映当前工况。
另一方面，离线取样本身也引入了额外的操作风险。取样操作可能带入杂菌，造成染罐事故。频繁取样还增加了操作人员的劳动强度，且每次取样都意味着一定量发酵液的浪费。
在这种背景下，发展能够原位、实时检测发酵液中氨基酸及其他关键物质浓度的技术，成为行业优化升级的重要方向。
目前氨基酸发酵行业中常用的浓度检测方法主要包括高效液相色谱法、酶电极法、近红外光谱法等，这些方法各有特点，但也各自存在一定的局限性。
1. 高效液相色谱法
高效液相色谱是氨基酸定量分析中精度较高的方法之一，能够对多种氨基酸进行同时分离和定量。但该方法需要样品前处理，检测时间较长，且设备和耗材成本较高。由于检测周期长，该方法难以满足过程实时控制的需求，通常只能用于离线分析或工艺验证环节。
2. 酶电极法
酶电极传感器基于特定酶对底物的催化反应实现浓度检测，具有响应速度快、选择性较好的特点。但酶电极的寿命有限，酶活性在复杂发酵环境中容易衰减，需要定期更换和校准。此外，一种传感器通常只能检测一种目标物，无法满足多组分同时监测的需求。
3. 近红外光谱法
近红外光谱技术具有快速、无损的优势，已在氨基酸发酵监测中有一定的研究应用。近红外光谱主要通过测量分子含氢基团的倍频和合频吸收来获取信息，其在水分含量较高的发酵体系中对某些组分的响应灵敏度相对有限，且光谱信息解释的直观性不如拉曼光谱。
综上，传统检测方法在实时性、信息获取效率和操作便利性等方面仍有提升空间，氨基酸发酵行业亟需一种能够在发酵过程中实时、多组分同时检测的技术手段。
在线拉曼光谱技术基于拉曼散射效应。当特定波长的激光照射到样品时，绝大部分光子发生弹性散射，散射光频率与入射光相同。然而，极小部分光子与分子振动或转动能级发生能量交换，散射光频率发生偏移，这种现象被称为拉曼散射。
拉曼位移的大小与分子中化学键的振动模式一一对应。不同化学键——如碳-氢键、碳-碳键、碳-氧键、碳-氮键等——具有各自特征的拉曼位移值，组合起来形成了分子独特的“指纹”光谱。这一特性使得拉曼光谱能够区分不同物质，包括结构相近的化合物。
对于氨基酸发酵体系而言，发酵液中存在多种成分：底物如葡萄糖、碳源物质；目标产物如谷氨酸、赖氨酸等氨基酸；副产物如乳酸、乙酸、乙醇等；以及菌体本身。每种组分都具有可识别的拉曼光谱特征，为同时检测多种物质提供了理论基础。
在线拉曼光谱技术应用于发酵过程浓度检测，具有以下几个方面的突出特点：
1. 无需样品制备，实现原位检测
拉曼光谱仪通过光纤探头可直接浸入发酵罐内或通过窗口穿透容器壁进行测量，不需要取样、稀释、过滤等样品前处理步骤。这不仅消除了取样操作带来的污染风险，也避免了样品在等待检测期间的成分变化。检测结果代表了罐内发酵液的实时状态，无时间滞后。
2. 不受水分子干扰
发酵体系以水为介质，水分子在红外区域有较强的吸收，会对近红外等光谱技术造成较大干扰。而水分子的拉曼散射截面较小，其信号在大多数拉曼光谱中不明显。这使得拉曼光谱在水性体系中具有良好的信噪比，特别适合发酵液等含水样品的在线分析。
3. 多组分同时定量
不同物质具有不同的拉曼特征峰，通过解析全波段光谱信息，可以同时获取多种底物、产物和副产物的浓度信息。这种多参数同时获取的能力，有助于全面把握发酵过程中的代谢状态。
4. 免标记检测
拉曼光谱技术无需对样品进行荧光标记或化学衍生处理，直接测量分子自身的振动光谱即可。这避免了标记物对检测结果的干扰，也降低了检测成本和操作复杂度。
一个完整的在线拉曼浓度检测系统通常由以下几个部分组成：
1. 激光光源
提供稳定的单色激发光，常见波长包括532纳米、785纳米和1064纳米等。785纳米激光在生物发酵领域使用较为广泛，该波长能够有效抑制样品产生的荧光背景干扰。
2. 光谱仪
负责收集样品产生的拉曼散射光，将其分光并转换为数字光谱信号。光谱仪的性能决定了系统的光谱分辨率和灵敏度。
3. 光纤探头
探头是系统与发酵罐的接口部件，直接浸入发酵液或通过窗口进行测量。探头需要具备耐高温、耐腐蚀、可原位清洗消毒等特性，以适应发酵生产环境。通常采用蓝宝石视窗和不锈钢外壳设计。
4. 数据处理与分析平台
该平台接收光谱仪输出的原始光谱数据，运行化学计量学模型，将光谱信息转化为各目标物质的浓度值，并输出至过程控制系统或显示界面。平台还需具备数据存储、趋势分析和报警功能。
北京鉴知RS2100在线拉曼分析仪用于生物过程中多种生化参数的原位、实时、连续监测。在生物制药领域，已应用于多种生物过程分析现场，包括生物发酵、肽类药物合成、酶催化反应等。尤其在生物发酵领域，该仪器已应用于抗生素、虾青素、氨基酸等多品种的生产过程，为工艺优化以及生产调控提供智慧之眼，可与DCS联调实现自动反馈调节。
在线拉曼光谱仪测得的是拉曼位移与信号强度之间的关系谱图，而非直接的目标物质浓度值。要将光谱信息转化为浓度数据，必须建立化学计量学模型。
建模过程通常包括以下步骤：
第一步，收集训练样本。在发酵过程中，于不同时间点同时采集拉曼光谱和离线参考浓度数据。参考数据可通过高效液相色谱等成熟分析方法获得，作为模型的“真值”或“标签值”。
第二步，光谱预处理。原始光谱可能包含基线漂移、噪声、荧光背景等干扰信息。常用的预处理方法包括平滑滤波、基线校正、归一化等，旨在突出目标信号、消除无关干扰。
第三步，变量选择与模型构建。利用偏最小二乘回归、主成分回归等多元统计方法，建立光谱数据与参考浓度之间的数学关联模型。在模型训练阶段，算法自动识别哪些拉曼位移位置的信号强度与目标浓度变化存在显著关联。
第四步，模型验证与优化。使用未参与训练的独立样本数据对模型进行交叉验证，评估其预测精度和泛化能力。根据验证结果对模型参数进行调整优化。
1. 偏最小二乘回归
偏最小二乘回归是拉曼光谱定量分析中常用的建模方法之一。该方法同时考虑光谱矩阵和浓度矩阵的结构信息，能够有效处理自变量（光谱波长点）数量远多于样本数量的情况。偏最小二乘回归对于多组分体系的预测能力较好，是目前发酵过程拉曼检测建模的主流方法之一。
2. 主成分回归
主成分回归首先对光谱数据进行主成分分析，提取少数几个能够代表绝大部分光谱信息的主成分变量，再用这些主成分与浓度数据建立回归模型。该方法能够有效降低数据维数、消除共线性问题，适用于光谱数据中噪声较大的情形。
3. 机器学习方法
近年来，机器学习方法在拉曼光谱建模中的应用逐渐增多。人工神经网络、支持向量回归等算法能够捕捉光谱与浓度之间非线性的复杂关联，在某些场景下可获得优于传统线性模型的预测精度。深度学习方法的引入进一步提升了模型对动态发酵过程的适应能力。
发酵过程具有强烈的动态性和批次间差异性。一批发酵的菌种状态、原料批次、工艺参数等因素都可能在微量层面发生波动。因此，基于一个批次数据建立的模型，移植到另一个批次使用时，其预测精度可能出现下降。
解决模型稳健性问题的途径包括：使用足够多批次的数据进行模型训练，使模型充分学习到发酵过程的一般规律；采用模型转移技术，将已有模型适应新的测量条件；利用单组分光谱补充法等方法在不增加大量发酵实验的前提下提升模型的跨批次适用性。
在氨基酸发酵体系中，在线拉曼检测技术可以针对多类目标物进行浓度监测：
1. 底物类
包括碳源物质如葡萄糖、蔗糖、糖蜜中的糖类成分，以及氮源物质如铵盐、氨基酸前体等。实时掌握底物浓度，是实现精准补料控制的前提，有助于避免底物过量抑制或饥饿限制，优化物料的投加策略。
2. 产物类
即发酵的目标产物——氨基酸。不同氨基酸的拉曼特征峰不同，使得在线拉曼具有同时监测多种氨基酸浓度的潜力。研究表明，通过拉曼光谱配合多元化学计量学模型，可在细胞培养体系中实现酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的定量检测。
3. 副产物类
发酵过程中可能伴随有机酸（如乳酸、乙酸）、醇类等代谢副产物的生成。这些副产物的积累浓度一旦超标，会对菌体生长和目标产物合成产生抑制作用。在线监测副产物浓度，有助于及时采取调控措施，将副产物积累控制在合理范围。
氨基酸发酵是一个动态变化的过程，从发酵启动到结束，底物浓度逐渐下降，产物浓度逐渐上升，菌体密度和代谢活性也在不断变化。在线拉曼检测系统能够连续跟踪这些变化。
连续采集的数据可以生成浓度-时间曲线，直观展示发酵进程。这些趋势信息比单一时间点的检测值更有价值——当曲线斜率发生异常变化时，往往意味着发酵过程出现了问题，如菌体活力下降、杂菌污染、营养物短缺等。及时识别这些异常信号，为操作人员提供了提前介入的窗口。
在线拉曼检测的价值不仅在于“看见”发酵过程，更在于与控制系统联动，实现自动化调控。
在补料发酵工艺中，补料策略的合理性直接影响产酸水平和原料利用率。通过在线拉曼实时监测底物浓度，当底物浓度低于设定阈值时，控制系统自动启动补料；当浓度达到上限时，自动停止补料。这种闭环控制避免了人工操作的滞后和偏差，实现了底物浓度的动态精准管理。
在实际发酵研究中，基于拉曼光谱的智能反馈控制已在碳源浓度精准控制方面取得良好的应用效果。相关技术路线的核心是构建“实时监测—智能预测—自动调控”的闭环架构，将发酵过程从依赖经验的间歇式操作向数据驱动的智能化调控转变。
在线拉曼检测系统的探头部署主要有两种方式：
1. 浸入式安装
探头通过发酵罐顶部的接口直接插入发酵液中，探头端部与发酵介质直接接触。这种方式测量路径最短，信号强度较高，但对探头的材质和密封性能要求较为严格，必须能够耐受发酵过程中的高温蒸汽灭菌和化学清洗。
2. 非接触式测量
探头安装在发酵罐的观察窗外部，激光透过窗口玻璃照射样品并收集拉曼信号。这种方式避免了探头与发酵液的直接接触，无需考虑探头灭菌问题，安装和维护也更为简便。但窗口玻璃的透光性会随时间衰减，需定期清洁维护。
选择哪种安装方式，需要考虑发酵罐的结构、工艺无菌要求、预算等因素综合决定。
激光波长的选择对在线拉曼检测效果有直接影响。较长波长（如785纳米、1064纳米）的激光穿透性较好，且能够有效抑制样品荧光背景，但拉曼信号强度随波长四次方衰减，长波长激光的散射信号较弱。较短波长（如532纳米）的拉曼信号较强，但更容易激发样品中的荧光干扰。
在氨基酸发酵应用中，785纳米激光波长使用较多，该波长在信号强度和荧光抑制之间取得了较好的平衡。
在线拉曼系统可实现连续采集，数据刷新频率可达到每秒数次甚至更高。但数据采集并非越密集越好。过高的采集频率会产生庞大的数据量，对存储和实时处理系统形成较大压力，同时发酵体系中各组分浓度变化是连续的、相对缓慢的，高频采样所获得的信息增量有限。
在实际应用中，可根据发酵过程的动态特性合理设置采样间隔。在发酵前期和中期，代谢变化较快，可适当提高采样频率；在发酵后期，代谢趋于平稳，可适当降低采样频率。
化学计量学模型在使用过程中需要进行定期维护和更新。随着菌种批次更替、原料来源变化、生产工艺调整，原始建模所依据的“训练数据”与当前工况之间的匹配程度可能发生变化，导致模型预测精度下降。
定期的模型性能评估是必要的。当发现预测值与离线实测参考值的偏差超出可接受范围时，需要重新校准模型或补充新的训练数据。也有一些研究提出了利用单组分光谱数据快速补充模型的方法，可以在不进行全面再校准的情况下提升模型的适用性。
在线拉曼光谱技术与人工智能的结合正在逐步深化。基于深度学习的分析方法，能够从连续采集的拉曼光谱时间序列中提取发酵过程的动态变化模式，实现对发酵状态的趋势预测。利用时间序列拼接机制整合多条光谱数据，可以捕捉发酵过程中的动态变化趋势，改善传统单时刻预测的滞后性。
随着算法研究的深入和数据积累的丰富，这一融合方向有望进一步提升在线拉曼浓度检测的预测精度和响应速度。
目前在线拉曼技术在氨基酸发酵中的应用主要集中在底物和若干种主要氨基酸的检测上。随着光谱数据库的不断完善和建模技术的进步，可检测的氨基酸种类将不断增加。同时，检测对象也将从单一的目标产物向多组分的综合代谢谱拓展，包括中间代谢物、能量代谢相关物质等。
通过优化光谱仪硬件性能、改进探头设计和数据处理算法，在线拉曼检测系统的测量精度有望持续提升。在建模方法方面，随着各种新型化学计量学算法的发展，模型对复杂发酵体系的适应能力和预测稳定性将不断增强。
在线拉曼技术的应用场景正在从实验室研究向工业发酵生产延伸。虽然氨基酸发酵以大宗产品为主，其批量和生产条件各具特色，但在线检测技术所提供的实时过程信息，对于理解发酵机理、优化工艺条件具有参考价值。随着行业对过程分析技术的重视程度不断提升，在线拉曼在该领域的应用逐步拓展。
结语：
氨基酸发酵浓度的实时检测是提升发酵过程控制水平的工程技术方向。在线拉曼光谱技术以其非侵入、免标记、多组分同时检测的技术特点，为这一需求提供了有潜力的技术方案。通过化学计量学模型将光谱数据转化为浓度信息，并结合过程控制系统，在线拉曼技术已在发酵过程研究中展现出良好的适用性。
尽管目前在线拉曼检测系统在荧光抑制、模型稳健性、系统成本等方面仍面临一些技术挑战，但随着仪器硬件性能的提升、数据处理算法的进步以及工程应用经验的积累，这些问题正在逐步得到解决。可以预见，在线拉曼光谱技术将在氨基酸发酵及其他生物制造领域的智能化升级中，发挥日益重要的支撑作用。
