发布日期：2026-08-26 10:53:56 生物发酵是现代生物制药、食品工业及生物化工领域的核心工艺环节。发酵过程中，微生物在适宜的温度、pH值和溶氧条件下，持续消耗营养物质并合成目标产物，整个过程是一个高度动态、非线性的复杂生物反应体系。长期以来，发酵过程的监测与控制高度依赖人工取样与离线分析，数据获取存在显著的时间滞后，难以满足精细化管理与实时调控的需求。
原位拉曼光谱技术作为一种分子光谱分析手段，通过捕捉分子振动产生的散射信号，可在不扰动发酵体系的前提下获取多组分浓度信息。该技术将分析检测从"离线滞后"转变为"在线实时"，为发酵过程的透明化与可控化开辟了新路径。本文将围绕该技术在生物发酵实时监测与质量控制中的应用展开系统论述。
（一）技术原理
拉曼光谱效应源于光与物质分子的非弹性散射作用。当激光照射到分子表面时，绝大部分光发生弹性散射，频率保持不变；仅有极少量光与分子振动能级发生能量交换，产生非弹性散射，即拉曼散射。散射光的频率偏移量与分子振动模式密切相关，不同化学键和官能团具有特征性的拉曼频移，构成了分子的"振动指纹"。
在生物发酵体系监测中，每一种待测组分——无论是葡萄糖、氨基氮等营养底物，还是抗生素、氨基酸等目标产物，乃至菌体本身的生物大分子——均具有各不相同的拉曼光谱特征。通过对发酵液进行连续光谱采集，并结合化学计量学方法建立定量模型，即可从复杂的光谱信号中解析出各组分的实时浓度变化。
（二）技术特点
原位拉曼光谱技术具备若干显著的技术特征。其一，该技术以光学方式实现非接触或微侵入式检测，不需要对样品进行萃取、稀释等前处理操作，保持了发酵体系的原始状态。其二，拉曼光谱对水分子信号不敏感，这一特性使其天然适用于水相发酵体系的分析，避免了水溶剂吸收对测量的严重干扰。
其三，该技术可在同一光谱采集过程中获取多组分信息，通过建立不同的定量模型实现同步定量，分析效率显著优于逐一组分分析的传统模式。其四，拉曼探头可通过光纤实现远距离传输，探头部分可耐受高温高压与蒸汽灭菌，满足发酵罐无菌环境的严苛要求。
（一）发酵过程的特点与挑战
生物发酵是一个涉及微生物代谢、传质传热和反应动力学的复杂过程。从菌种接种到发酵结束，微生物依次经历延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期，每个阶段的代谢特征与营养需求各不相同。在指数生长期，菌体快速增殖，大量消耗碳源和氮源；进入稳定期后，菌体生长速率放缓，目标产物的合成逐渐占据主导地位。
这一动态特性意味着，发酵过程的状态评估不能仅依靠起始和终点的"两头检测"，而需要对过程中各关键参数的连续追踪。营养底物的消耗速率反映菌体的代谢活性，目标产物的积累曲线指示合成效率，菌体浓度以光密度OD值表征体现生物量增长趋势。这些参数之间相互关联、彼此影响，构成了一个动态平衡的监测体系。
传统发酵控制的困境在于，操作人员对罐内真实状态的了解存在时间差。当离线检测报告反馈到车间时，发酵状态可能已经发生了显著偏移，补料和通气的调节往往滞后于实际需求，导致代谢路径偏移、副产物累积，最终影响目标产物的得率与品质。
（二）传统监测方法的局限性
传统发酵监测主要依赖人工定时取样与实验室分析。操作人员每隔固定时间间隔从发酵罐中抽取样品，送至实验室进行效价测定、糖浓度分析、氨基氮检测和菌体计数等。这一模式存在多方面的不足。
取样过程本身引入了体系扰动风险。每次取样都意味着发酵罐的密封性被打破，增加了杂菌污染的概率。在长周期发酵中，频繁的取样操作累积的染菌风险不容忽视，一旦发生污染，整批发酵液面临报废，经济损失巨大。
离线分析的时间成本高昂。从取样到获得检测结果，通常需要数小时的等待周期。在此期间，发酵过程持续进行，操作人员只能依据过往经验进行粗略判断，无法实现基于实时数据的精准调控。补料时机的选择往往滞后于真实的营养需求，通气量的调整也难以匹配菌体的实时呼吸强度。
此外，传统分析手段通常只能逐一组分检测，获取单批次发酵的全过程数据需要大量的人力投入和检测时间，数据密度远不能满足精细化工艺优化的需求。
（一）实时在线监测能力
原位拉曼光谱技术最突出的优势在于其实时在线监测能力。通过将拉曼探头直接浸入发酵罐内，或通过旁路引出方式连接流通池，光谱信号可以在发酵进行过程中持续采集，无需中断生产流程。
探头浸入式部署方式下，拉曼探头通过标准法兰接口安装于发酵罐侧壁或顶部，探头前端的光学窗口直接与发酵液接触。激光通过光纤传导至探头，聚焦在发酵液中，散射光经同一光学路径返回光谱仪进行解析。整个过程不涉及取样和样品转移，实现了真正意义上的原位监测。
实时监测带来的价值不仅在于数据获取速度的提升，更在于数据连续性的保障。传统离线分析一天仅能获取数个离散数据点，而在线拉曼监测可在数秒至数十秒的时间尺度上连续输出浓度数据，形成密集的过程数据曲线。这些曲线直观反映了各组分浓度的变化趋势，使操作人员能够准确把握发酵过程的动态演变。
（二）多组分同步分析
拉曼光谱的多组分同步分析能力是该技术在发酵监测领域的核心优势之一。在一次光谱采集过程中，发酵液中所有具有拉曼活性的分子都会贡献各自的特征散射信号。通过对全光谱范围内不同波段的特征峰进行解析，可以在单次测量中同时获取多种组分的浓度信息。
在生物发酵体系中，需要监测的关键组分通常包括碳源（如葡萄糖、蔗糖）、氮源（如氨基氮、铵盐）、菌体生物量（以OD值表征）以及目标产物（如抗生素效价、氨基酸浓度等）。这些组分在拉曼光谱中各有特征谱带位置，通过化学计量学多元校正方法，可建立各组分与光谱信号之间的定量关系模型。
多组分同步分析的优势在于效率的提升和成本的节约。传统模式下，每种组分需要不同的分析方法和仪器设备，而拉曼光谱技术以一次测量覆盖多组分，大幅减少了分析时间和人力资源投入。同时，同步获取的多组分数据之间存在内在的代谢关联，为发酵过程的综合评估提供了更全面的信息支撑。
（三）无损检测特性
拉曼光谱分析是一种无损检测技术。激光与分子的相互作用仅涉及光子的非弹性散射，不改变分子的化学结构和反应状态，不消耗样品，不产生废弃物。这一特性在生物发酵监测中具有特别重要的意义。
发酵液中的微生物是一个活的生物体系，任何化学或物理的扰动都可能影响其代谢活动。传统的取样分析需要从发酵罐中移出液体，经过离心、过滤、稀释等处理后才能上机检测，处理过程可能改变样品的原始状态，导致检测结果与罐内真实情况产生偏差。
原位拉曼监测完全避免了上述问题。探头直接在发酵罐内进行光学测量，不取出、不处理、不消耗样品，检测后样品仍然留在发酵体系中继续参与反应。这不仅保证了检测数据对罐内真实状态的高保真反映，还实现了检测过程的零样品损耗，对于珍贵菌种和长周期发酵具有显著的经济价值。
（四）快速响应特性
拉曼光谱的采集速度快，单次测量通常在数秒至数十秒内即可完成。这一响应速度远超传统离线分析方法，使发酵过程的实时调控成为可能。
在发酵过程的关键节点——如指数生长期向稳定期过渡的拐点、补料后的底物消耗拐点、代谢路径切换的临界点——状态变化可能在短时间内发生。如果分析手段的响应时间过长，这些关键拐点可能在数据反馈之前就已经错过，导致调控时机丧失。
快速响应的另一个价值在于异常状态的及时预警。当发酵过程出现染菌前兆、代谢异常或补料过量等情况时，拉曼光谱能够在短时间内捕捉到组分浓度的异常变化，为操作人员争取宝贵的干预时间窗口，避免损失进一步扩大。
（一）营养物浓度的实时监测
碳源和氮源是微生物生长与产物合成的基础营养物质。在发酵过程中，营养底物的浓度变化直接反映了菌体的代谢活性和营养需求。底物浓度过高可能导致抑制效应，过低则限制菌体生长和产物合成，精准掌握底物浓度是优化补料策略的前提。
原位拉曼光谱技术通过在发酵液中的直接光学测量，可以实时追踪碳源（如总糖、还原糖）和氮源（如氨基氮）的浓度变化趋势。拉曼探头持续采集光谱信号，化学计量学模型自动解析出各营养组分的实时浓度，并将数据传输至中控系统。
操作人员据此可以动态判断菌体对营养物质的消耗速率，在底物浓度降至补料阈值时及时启动流加操作，避免因底物匮乏导致的代谢停滞，同时防止因过度补料引发的抑制效应。这种基于实时数据的补料模式，相较于传统凭经验定时定量的粗放方式，在产物得率和原料利用率方面均有明显改善。
（二）菌体生长状态的评估
菌体生物量是衡量发酵进程的重要参数。菌体浓度的变化趋势反映了微生物的生长阶段和健康状态，是判断发酵是否处于正常轨道的关键依据。传统方法通过取样后测定光密度OD值来估算菌体浓度，存在取样滞后和操作繁琐的问题。
拉曼光谱技术可以通过两种途径实现菌体生长状态的实时评估。一方面，菌体生物大分子（蛋白质、核酸等）具有特征性的拉曼光谱信号，通过建立OD值与光谱信号的关联模型，可以实现菌体浓度的在线预测。另一方面，菌体代谢活动的间接指标——如营养底物消耗速率和尾气组分变化——也可以通过拉曼监测获取，为菌体生长状态的综合判断提供多维度信息。
菌体生长状态的实时评估使发酵阶段的判断更加精准。操作人员可以清晰区分延滞期、指数生长期和稳定期，在每个阶段采取针对性的调控策略，避免因阶段判断失误导致的资源浪费或产物损失。
（三）目标产物浓度的追踪
目标产物的积累是发酵过程的最终目标，产物浓度的实时追踪对于发酵终点的判定和放罐时机的把握至关重要。传统模式下，产物浓度的检测依赖于实验室的效价测定，结果通常在取样数小时后才能获得，放罐决策往往带有一定盲目性。
原位拉曼光谱技术可以在发酵过程中持续追踪目标产物的浓度变化。不同产物分子具有各自的拉曼特征谱带，通过建立产物浓度与光谱信号的定量模型，可以实现产物浓度的在线实时预测。
产物浓度曲线的实时追踪使放罐决策更加科学。当产物浓度曲线趋于平台，表明合成速率已显著放缓，继续延长时间带来的产物增量有限，此时是合理的放罐时机。反之，若产物浓度仍在快速上升，则应延长发酵时间以获取更多产物。基于实时数据的放罐决策避免了过早放罐导致的产物损失和过晚放罐导致的能耗浪费。
（四）补料策略的优化
补料策略是发酵工艺优化的核心环节之一。合理的补料策略应根据菌体的实时营养需求和代谢状态，动态调节补料速率和补料组成，使底物浓度维持在合理窗口内，既不过量也不过少。
原位拉曼光谱技术为补料策略的优化提供了数据基础。通过将拉曼监测的底物浓度数据实时接入中控自控系统，与补料系统形成联动控制，可以实现基于实时反馈的自动补料。当总糖拉曼信号显示底物浓度低于设定阈值时，补料系统自动加快流加速率；当底物浓度回升至设定上限时，补料速率自动下调。
这种闭环反馈控制模式将补料精度从"定时定量"提升至"按需供给"，有效避免了补料不及时或过量补料的问题。补料精准度的提升不仅有利于目标产物得率的提高，也减少了原料浪费和能耗支出，体现了过程优化的直接经济效益。
（一）尾气组分监测的意义
发酵尾气是微生物代谢活动的直接表征。在好氧发酵过程中，微生物通过呼吸作用消耗氧气、排出二氧化碳，尾气中各组分的浓度变化忠实记录了菌体的代谢轨迹。氮气作为惰性载体气，其浓度相对稳定；氧气和二氧化碳的浓度变化则直接反映了菌体的呼吸活性和碳代谢强度。
传统尾气分析多采用离线方式或响应较慢的传感器组合，难以实现多组分同步检测和高频数据输出。原位拉曼光谱技术可对发酵尾气中的氮气、氧气、二氧化碳、氢气、甲烷等组分进行同步在线定量分析，单次检测在数十秒内完成，无需色谱分离，数据连续输出。
尾气组分监测的意义在于其"无扰"特性。尾气分析不需要从发酵罐内取样，不影响发酵体系的密封性和无菌性，从根本上消除了取样带来的染菌风险。同时，尾气组分的变化往往先于液相参数的变化出现，使尾气分析具有早期预警的价值。
（二）代谢参数的计算
基于尾气组分数据，可以计算发酵过程的核心代谢参数。二氧化碳释放率CER反映菌体碳代谢的总量，摄氧率OUR表征菌体的耗氧活性，呼吸商RQ即CER与OUR的比值则指示菌体代谢路径的类型。
这些代谢参数的实时计算依赖于尾气组分的连续监测数据。拉曼光谱技术提供的高频、多组分尾气数据，使CER、OUR和RQ的计算可以在实时尺度上进行，形成连续的代谢参数曲线。
呼吸商的异常变化往往预示着发酵状态的偏移。当RQ偏离正常范围时，可能意味着菌体代谢路径发生了切换，或者发酵体系出现了异常情况如杂菌污染、底物抑制等。通过实时监控RQ的变化趋势，操作人员可以及时发现这些异常信号并采取干预措施，避免问题进一步恶化。
（三）发酵阶段的判断
尾气组分的连续监测数据为发酵阶段的判断提供了客观依据。在延滞期，菌体尚未开始活跃代谢，耗氧率和二氧化碳释放率处于较低水平；进入指数生长期后，菌体代谢活跃，OUR和CER快速上升；到达稳定期后，代谢活性趋于平稳，OUR和CER维持在相对稳定的水平。
基于拉曼尾气数据实时计算的代谢参数曲线，可以清晰地呈现这些阶段特征，使发酵阶段的转换节点可被准确识别。这比仅依靠经验或离散的离线数据来判断阶段更加可靠和科学。
发酵阶段的准确判断对于工艺调控具有重要意义。不同阶段对营养条件和环境参数的要求不同，准确掌握阶段转换的时机，可以及时调整通气量、搅拌速率、补料策略和温度控制等参数，使发酵过程始终处于合理运行状态。
（一）过程质量控制体系的构建
现代发酵质量控制理念强调从"终点检验"向"过程控制"的转变。传统的质量控制模式在发酵结束后对产品进行检测，合格则放行、不合格则报废，属于事后把关，无法挽回过程中已经造成的损失。
基于原位拉曼光谱技术构建的过程质量控制体系，将质量控制点前移至发酵过程之中。通过实时监测关键工艺参数——包括营养底物浓度、菌体生物量、目标产物浓度和尾气代谢参数——建立全过程的质量监控链条，使每一步工艺操作都有数据支撑，每一项质量决策都有实时依据。
过程质量控制体系的核心是将"检测—判断—调控"三个环节形成闭环。拉曼光谱技术提供了实时检测能力，化学计量学模型提供了数据解析和判断能力，中控系统与补料、通气等执行机构提供了调控手段。三者协同，构成了从数据获取到过程干预的完整闭环控制链条。
（二）实时数据与反馈控制
实时数据的价值在于其对过程调控的即时指导作用。原位拉曼光谱技术产生的连续数据流，为发酵过程的反馈控制提供了信息基础。
反馈控制的基本逻辑是：监测参数偏离设定目标值时，控制系统自动执行调节动作，使参数回归目标范围。在发酵过程中，拉曼监测的底物浓度数据可以驱动补料系统的自动调节，尾气组分数据可以驱动通气系统的自动调节，代谢参数的异常变化可以触发预警和人工干预。
实时数据驱动的反馈控制将发酵过程从"开环操作"转变为"闭环控制"，显著提升了过程的可控性和稳定性。在开环模式下，操作人员依据经验和固定参数进行操作，过程状态的实际偏差无法被及时感知和纠正；在闭环模式下，过程偏差被实时捕捉和修正，发酵过程更加接近合理运行轨迹。
（三）染菌风险的降低
染菌是发酵工业面临的重大风险之一。杂菌的侵入会导致目标菌种被竞争抑制，发酵液变质，产物被降解或污染，严重时整批发酵液报废，造成重大经济损失。
传统取样分析模式中，频繁的取样操作是染菌风险的主要来源之一。每次取样都需要打开发酵罐的取样阀或采样口，增加了环境微生物侵入的机会。取样频率越高，染菌风险越大；而降低取样频率又会牺牲数据密度，两者构成矛盾。
原位拉曼光谱技术通过旁路非接触监测或探头浸入式监测方式，大幅减少了取样操作的频次。探头通过标准法兰安装于发酵罐上，配备可蒸汽灭菌SIP的光学窗口，在安装和维护过程中经过严格灭菌处理，安装后即长期在线运行，无需反复打开罐体。这种监测方式在保障数据密度的同时，从根本上降低了染菌风险，实现了监测与安全的兼得。
（一）探头设计与部署
探头是原位拉曼光谱技术与发酵体系直接接触的关键部件，其设计直接关系到测量结果的可靠性和长期运行的稳定性。在生物发酵应用中，探头需要满足多个方面的要求。
光学性能方面，探头应具有高效的激光传输和散射光收集能力，确保在发酵液这一高散射、高荧光背景的复杂介质中获得足够信噪比的拉曼信号。机械性能方面，探头应耐受发酵过程中的搅拌剪切力和罐内压力，材料应具有生物相容性，不对发酵微生物产生毒性影响。
在部署方式上，侧插式安装适用于中小型发酵罐，探头从罐壁侧面水平插入，探头前端位于搅拌流场中，保证测量区域具有代表性的物料流动。顶插式安装适用于大型发酵罐，探头从罐顶垂直向下插入，探头长度可达数米，需要保证深入发酵液面以下足够的深度，同时避免与搅拌桨叶干涉。
探头的可灭菌性是生物发酵应用的特殊要求。探头必须能够承受蒸汽灭菌的温度和压力条件，光学窗口和密封结构在多次灭菌循环后仍保持性能稳定。此外，探头表面应具有光洁的表面处理，减少物料粘附和微生物滋生。
（二）化学计量学模型
化学计量学模型是将拉曼光谱信号转化为浓度信息的数学桥梁。在多组分发酵体系中，光谱信号与组分浓度之间的关系是复杂的多元映射，需要借助化学计量学方法建立定量校正模型。
模型建立的基本流程包括：收集不同浓度条件下的发酵液样品及其拉曼光谱，以实验室标准分析方法获取各组分的参考浓度值，然后通过偏最小二乘回归等方法建立光谱矩阵与浓度矩阵之间的数学关系。模型建立后需要经过严格的交叉验证和外部验证，确保预测结果的准确性和可靠性。
模型维护是长期运行的保障。发酵过程的物料来源、菌种特性和工艺参数可能随时间发生变化，导致模型的预测性能逐渐下降。定期收集新的校准样品对模型进行更新和修正，是维持模型预测精度的必要措施。此外，模型应具备异常光谱识别能力，当输入光谱超出模型有效范围时及时报警，避免输出不可靠的预测值。
（三）系统集成与数据对接
原位拉曼光谱技术要在发酵过程中发挥实际价值，不能孤立运行，而需要与工厂的中控系统、数据管理系统和生产执行系统实现无缝集成。
在数据传输层面，拉曼分析仪应支持标准工业通信协议，将实时浓度数据、光谱质量指标和设备运行状态等信息传输至中控系统。中控系统接收到拉曼数据后，将其与发酵罐的其他工艺参数（温度、pH值、溶氧、搅拌速率等）进行综合显示和分析，形成发酵过程的全景数据视图。
在控制执行层面，拉曼数据应能够触发下游控制动作。当底物浓度数据触发补料阈值时，中控系统向补料泵发送调节指令；当尾气组分数据触发通气调节条件时，中控系统向通气控制阀发送调节指令。这种数据到动作的闭环联动，是将监测数据转化为生产效益的关键环节。
在数据管理层面，拉曼监测产生的全过程数据应纳入工厂的数据管理系统，形成可追溯的电子记录。这些数据不仅服务于当前批次的质量评估，还为工艺优化、批次对比和持续改进提供数据基础。
（一）技术发展方向
原位拉曼光谱技术在生物发酵领域的应用仍在持续深化和拓展。从技术自身发展来看，有几个值得关注的方向。
在光谱硬件方面，激光器的小型化和探测器灵敏度的提升将继续推动分析仪向更紧凑、更高性能的方向演进。激发波长的选择更加多样化，以适应不同类型发酵液的荧光背景特性，在特定场景下选用长波激发可以有效抑制荧光干扰，获取更高质量的拉曼信号。
在数据处理方面，机器学习和深度学习方法在光谱解析中的应用日益深入。传统化学计量学方法在处理高度重叠的复杂光谱时存在局限，智能算法可以自动提取光谱中的深层特征，提升多组分定量模型的预测精度和鲁棒性。自动建模和模型自适应更新技术的发展，将降低模型维护的专业门槛和人力成本。
在应用拓展方面，该技术从单一的液相监测向液相与气相协同监测发展。同一套拉曼分析系统同时覆盖发酵液组分和发酵尾气组分，实现液相代谢与气相代谢的同步观测，为发酵过程的综合评估提供更全面的数据支撑。
（二）应用前景
随着生物制造产业的转型升级和智能制造理念的深入推广，原位拉曼光谱技术在发酵过程监测领域的应用前景广阔。
在法规层面，过程分析技术PAT理念日益得到监管机构的倡导和支持。PAT强调通过对关键质量属性和关键工艺参数的实时监测，建立基于科学知识和风险评估的过程控制策略。原位拉曼光谱技术天然契合PAT的技术理念，其实时、多组分、过程化的分析特征为PAT的实施提供了理想的工具。
在产业层面，发酵企业面对日益激烈的市场竞争和不断上升的人力成本，对生产过程的智能化和精细化提出了更高要求。原位拉曼光谱技术作为实现发酵过程透明化和闭环控制的关键技术手段，将在推动发酵工业从"经验驱动"向"数据驱动"转型中发挥重要作用。
从技术成熟度来看，该技术已在多个发酵品种的生产实践中得到验证，从实验室研究到工业化应用的转化路径已经打通。未来，随着硬件成本的进一步降低和数据分析能力的持续提升，该技术的应用覆盖面有望向更广泛的产业群体拓展，为更多发酵品种的过程优化与质量控制提供技术赋能。
原位拉曼光谱技术以其非接触、无损、多组分同步定量的技术特征，为生物发酵过程的实时监测与质量控制提供了一种切实有效的分析手段。
该技术将发酵过程从"黑箱操作"推向"透明管控"，使营养底物消耗、菌体生长状态、目标产物积累和尾气代谢活动等关键参数均可被实时感知和动态调控。随着技术的持续成熟和应用经验的不断积累，该技术有望在更广泛的生物制造领域发挥过程优化与质量保障的支撑作用，推动发酵工业向智能化与精细化方向稳步迈进。
