发布日期：2026-08-27 10:48:21 发酵是微生物在受控条件下将底物转化为目标产物的复杂生物过程，也是制药、食品、生物化工等领域广泛采用的基础性工艺单元。长期以来，人们对发酵罐内真实状态的把握，主要依赖定时取样与实验室分析。取样、送检、等待结果，再据此调整工艺，这一循环不仅耗时，而且难以捕捉过程中的关键变化，制约着发酵过程的精细化控制。
随着生物制造规模的扩大与质量要求的提高，仅仅回答"反应结束了吗"已经不够，人们更希望知道"罐内正在发生什么、接下来会走向哪里"。这要求过程检测提供及时、连续、可靠的化学信息，也促使监测方式从离线走向在线。
拉曼光谱技术的引入正在改变这一局面。它让过程检测从取样送检走向原位直读，无需中断生产即可持续获取罐内的化学信息。本文围绕拉曼光谱在发酵过程监测中的应用，从监测方式的演进、技术优势、应用场景、方法学突破与当前挑战等层面展开讨论，以期为相关工艺的开发与改进提供参考。
理解拉曼光谱的价值，需要先回到发酵过程监测本身。监测方式的选择，决定了我们能够获得何种质量的过程信息，也决定了工艺控制所能达到的精细程度。
（一）离线取样的固有局限
传统发酵监测以人工取样为主。操作人员按规定时间间隔从罐内取样，送实验室完成指标分析，再将结果反馈到生产环节。这一流程看似简单，却在多个环节埋下效率与质量的隐患。
1、时间滞后明显。从取样、送样到出具结果，往往需要数小时。发酵过程中菌体代谢处于连续变化之中，过期的数据难以反映当前状态，更无法支撑及时的决策。
2、信息不连续。离线检测得到的是一个个孤立的快照，代谢曲线上的关键节点，如底物耗尽、产物积累、菌体进入特定生理阶段等，常常被取样间隔错过。
3、污染与安全风险。频繁取样可能破坏发酵罐的无菌环境，增加染菌概率；对含有活性微生物或具有一定毒性的发酵体系，取样过程也伴随人员接触风险。
此外，人工取样检测意味着持续的人力投入与较高的检测成本。在多罐并行、批次频繁切换的生产场景下，这一问题尤为突出。数据滞后还可能造成批次判断失准、物料浪费甚至整批报废，损失往往难以挽回，这也促使行业寻找更高效的监测方式。
离线模式还难以应对快速变化的工艺。当反应进程明显加速或出现突发状况时，间断的数据往往来不及反映局势，生产调整只能依赖经验判断，控制的精细程度因此受到限制。
（二）过程监测需求的升级
发酵过程控制正从粗放走向精细。精准补料、终点判断、批次一致性保障、工艺放大等环节，都迫切需要及时、连续、可靠的过程数据作为支撑。补料时机的把握、通气策略的调整、放罐时刻的选择，每一项决策背后都需要对罐内状态的准确认知。
质量管理理念也在发生变化。以最终检验为主的质量控制模式，正在逐步转向对过程的实时监控与主动干预，强调过程数据的价值。这一转变与过程分析技术的思路相契合，为在线检测手段进入发酵车间提供了广阔空间，也对检测手段的信息丰富度提出了更高要求。
正是在这样的背景下，各类在线检测技术陆续得到应用。其中，拉曼光谱技术因独特的分子识别能力与较强的工程适应性，逐渐成为发酵过程监测领域备受关注的技术方向。
（三）拉曼光谱的基本原理与定位
拉曼光谱基于分子对入射光的非弹性散射效应。当光照射到样品时，部分散射光的频率发生变化，这种变化与分子内部的振动、转动能级一一对应，从而形成具有高度特征的散射光谱。由于不同化学基团、不同分子结构的振动模式各不相同，拉曼光谱常被称为分子指纹，能够在不破坏样品的前提下提供丰富的化学组成信息。
对发酵过程而言，罐内体系以水为基本介质，而水的拉曼散射信号较弱。这一特性使拉曼光谱能够在水相背景下较好地分辨溶质信息，适合直接面向发酵液进行测量，也为在线原位检测创造了条件。拉曼光谱的谱带位置与物质结构存在明确对应关系，这为复杂体系中的组分识别提供了可靠基础。
与只能反映温度、压力等物理量的常规传感器不同，拉曼光谱直接提供化学组成信息，信息维度更为丰富；与需要分离、衍生化处理的分析方法相比，它又省去了繁琐的前处理环节。这些特点共同决定了拉曼光谱在过程监测场景中的独特定位。
需要说明的是，拉曼光谱并非适用于所有场景。当目标组分含量极低、体系荧光强烈或基质干扰复杂时，需要评估方法的适用性，必要时与其他分析手段配合使用，这也体现了过程监测技术选择的综合考量。
与离线分析手段相比，拉曼光谱在发酵过程监测中展现出多方面的特点。这些特点并非孤立的性能指标，而是相互配合，共同构成了在线原位监测的技术基础。
（一）无损无扰的原位测量
拉曼光谱测量无需取样，通过浸入式探头或流通式光路即可直接获取罐内信息。测量过程不消耗样品、不引入试剂，也不会改变发酵体系的组成与状态。
1、探头可直接安装于发酵罐的预留接口，与罐体共同进行蒸汽灭菌，满足生物制药领域对无菌操作的要求。
2、测量全程无样品转移，从根本上消除了取样带来的污染隐患，也避免反复开罐对生产节奏的干扰。
3、对含有活性微生物的体系，无损测量意味着菌体状态不受扰动，所获数据更能反映真实的代谢情况。
（二）多组分同步获取
一张拉曼光谱中包含的信息远不止一个组分。通过适当的方法学处理，可以同时关联底物浓度、产物浓度、中间代谢物含量乃至菌体相关信号，实现多参数的同步观测。
1、一次测量即可获得多个关键参数，避免了为不同指标分别建立检测流程的繁琐。
2、各参数在同一时间轴上呈现，组分之间的动态关联一目了然，有助于还原发酵过程的整体面貌。
3、随着数据量的积累，还可进一步挖掘组分之间的耦合关系，为过程理解提供更深层次的信息。
（三）分子层面的高特异性
发酵液是成分复杂的多相体系，除目标产物外，还含有培养基组分、代谢副产物、细胞及其碎片等多种物质。传统检测手段常需分离或衍生化处理，而拉曼光谱凭借分子振动特征，能够在复杂基质中分辨目标物质的特征信号。
这种特异性还体现在对物质形态变化的敏感上。对于存在多种晶型或构象差异的物质，拉曼光谱能够捕捉细微的结构变化，为发酵相关的提取、结晶等下游环节提供过程信息。分子层面的分辨能力，使拉曼光谱在面对成分复杂的发酵样品时依然能够保持较好的选择性。
在定性鉴别方面，拉曼光谱同样具有实用价值。将未知样品的光谱与标准谱库比对，可以快速判断物料身份、发现异常组分，为过程监控提供便捷的筛查手段。
当然，高特异性并不意味着零干扰，发酵体系中组分重叠、谱带展宽等现象仍然需要借助数据处理手段加以处理，这也是方法学研究持续关注的问题。
（四）快速响应与连续监测
拉曼光谱的单次采集时间很短，可以高频率地连续输出数据，形成完整的代谢动态曲线。与离线检测的间断式数据相比，连续数据能够捕捉快速变化的过程，为及时干预创造条件。
1、代谢拐点、底物耗尽的瞬间等关键事件，能够在发生时即被记录，避免事后推测。
2、数据的连续性与可追溯性，为批次分析、工艺复盘与质量调查提供了扎实的过程记录基础。
3、在多批次生产中，连续数据还能支持批间对比，帮助识别工艺漂移的早期迹象。
连续监测的另一个好处是便于建立过程基线。在批次运行正常时积累的典型曲线，可以作为后续批次比较的参照，使异常波动更容易被识别。
（五）低耗材与长周期运行
拉曼光谱测量不依赖色谱柱、载气、显色试剂等消耗品，日常维护以探头清洁与系统检查为主，长期运行成本较低，适合在连续生产场景中长期在线运行。
随着光纤传导技术与工业探头设计的不断成熟，仪器主机可以布置在远离罐体的位置，探头深入现场，进一步提升了系统的可靠性与部署灵活性。较低的运维负担，使在线拉曼系统能够在多罐、多工段的场景下持续发挥作用。
在线检测还减少了取样耗材与实验室检测产生的废弃物，运行过程本身较为清洁，契合制造过程清洁化的发展方向，也为企业在环保管理方面减轻了负担。
发酵过程监测的需求并非一成不变，而是随着工艺阶段、生产方式与研究目的的变化而变化。理解这些差异，有助于合理规划在线监测的应用方式。
（一）不同发酵阶段的监测重点
一个典型的发酵过程通常经历菌体生长、代谢产物积累、放罐等阶段，每个阶段的关注点各不相同。
1、生长阶段侧重底物消耗与菌体生长状态的把握，为通气与营养供给策略提供依据。
2、产物合成阶段侧重产物浓度的动态变化与代谢中间物的走向，直接关系收率与质量。
3、放罐阶段侧重终点判断，过度延时会增加成本与杂质，过早放罐则损失产量，需要依靠过程数据作出权衡。
拉曼光谱的多组分同步能力，使这些在不同阶段各有侧重的监测需求，可以在同一套系统上连续实现。
当然，具体阶段划分会因菌种与产品类型而有所差异，监测指标的选取也需要结合工艺特点灵活调整。
（二）不同工艺模式的适配
发酵工艺既有批次生产，也有补料分批与连续培养等多种模式，在线监测的配置方式也随之调整。
1、批次工艺相对固定，监测重点在于批次内的过程重现性与终点判断。
2、补料分批工艺中，底物浓度的实时把握尤为关键，光谱数据可以直接服务于补料策略的调整。
3、连续培养对实时性与稳定性的要求更高，连续采集的光谱数据能够及时反映稳态的维持与偏离。
探头安装方式、数据采集频率与建模策略，都可以根据不同工艺模式的特点进行针对性设计，体现了在线监测系统的适应能力。
在线监测系统的灵活性，使其能够在不改变工艺主体的前提下，通过调整测量与建模配置适配不同工艺模式，降低了系统切换的代价。
（三）从工艺研究到生产放大的衔接
在线监测的价值贯穿工艺开发的全链条。在小试阶段，它帮助研究人员看清反应进程、筛选条件；在中试阶段，它支撑工艺参数的确认与优化；在生产阶段，它保障工艺的稳定执行与批次一致性。
这一衔接建立在数据的一致性之上。不同规模下获得的在线数据采用相近的采集与处理方法，便于横向对比，也为工艺放大提供了连续的证据链。将在线监测纳入工艺开发的早期设计，可以避免后期补建带来的重复工作。
光谱数据本身是测量结果，而过程监测需要的是对工艺状态的判断。将两者连接起来的，是采样工程、定量建模与过程控制等方法学的持续突破。
（一）采样工程化与探头设计
将实验室光谱仪延伸到工业发酵罐，首先需要解决探头与光路的工程化问题。浸入式探头需耐受发酵液的化学环境，具备良好的密封性能，并能在高压蒸汽灭菌条件下保持稳定。
1、光纤的引入使光信号可以在罐体与主机之间长距离传输，主机得以布置在洁净区之外，便于维护与防爆管理。
2、探头结构与安装接口的标准化，使设备可以在不同规模、不同型号的发酵罐之间移植复用。
3、从实验室小试罐到生产级大罐，探头的耐温、耐压、耐腐蚀能力以及光路稳定性都需要相应验证，这是在线拉曼系统从研究工具走向生产装备的关键一步。
采样工程化的另一层含义是探头位置的优化。探头所处的流场环境、搅拌状态都会影响测量代表性与信号质量，安装方案需要在工程经验与流体分析的基础上确定。
（二）化学计量学与定量建模
拉曼光谱本身是谱形信息，要转化为组分浓度等定量结果，需要借助化学计量学方法。通过设计合理的标定实验，采集覆盖工艺波动范围的样本，将光谱数据与参考分析值关联，即可建立定量模型。
1、建模过程涉及光谱预处理、特征筛选、多元校正与模型验证等多个环节，每个环节都有成熟的方法可供选择。
2、发酵液基质随工艺阶段动态变化，模型需要兼顾不同批次的差异，并通过定期校验与更新维持预测的可靠性。
3、独立批次的外部验证是模型可靠性的重要保障，能够检验模型在未见数据上的表现，避免过拟合带来的偏差。
模型的转移复用也是方法学研究的重点方向。跨仪器、跨规模的模型迁移正在逐步成为现实，降低了重复开发的工作量，为多基地、多生产线的规模化应用提供了便利。
光谱数据的质量评估同样不可忽视。通过记录信噪比、基线漂移等指标，可以及时发现测量条件的变化，为数据可靠性判断提供依据。
（三）多参数联动的过程表征
发酵过程是一个多变量耦合的动态系统，单一参数往往难以完整描述其状态。拉曼光谱在一次测量中携带的丰富信息，使底物消耗、产物积累、代谢中间产物变化等多个维度能够在同一时间尺度上被同步观察。
1、由此可以获得各组分的动态曲线，进而计算消耗速率、生成速率等衍生信息。
2、这些衍生信息帮助研究人员还原代谢路径的走向，识别工艺窗口，为条件优化提供依据。
3、从测浓度到看过程的转变，是方法学层面的重要进展，也拓宽了光谱数据在工艺研究中的用途。
（四）从监测走向控制闭环
在线测量的最终价值在于支撑决策。光谱数据接入自控系统后，可以与补料泵、通气系统、温度调节等执行机构联动，形成闭环反馈控制。
1、底物反馈补料：当底物浓度下降至设定范围时，系统自动调整补料速率，使底物维持在适宜水平，避免过量或不足带来的代谢路径偏移。
2、通气与搅拌联动：依据代谢活性的变化趋势调节供氧强度，兼顾产物合成与能耗控制。
3、终点自动判定：放罐时机不再依赖固定时长或人工经验，而是依据过程指标的实时变化作出判断。
这种由数据驱动的自动调节，明显降低了人工干预的依赖，也使工艺执行更加稳定一致。从人工取样、事后判断，到在线监测、实时调控，控制模式的升级让发酵工艺的稳健性与批次一致性得到有效提升，也减少了人为因素带来的波动。
（五）代谢状态的间接表征
除直接测量罐内液相组分外，对发酵体系相关气相信息的连续观察，也能为代谢状态提供有价值的间接线索。微生物在生长代谢过程中与外界的气体交换，与其生理活性存在密切关联。
1、通过分析相关气体组分及其变化趋势，可以推断微生物代谢活动的强度与路径特征。
2、这类间接表征与罐内液相监测相互印证，共同构成更为完整的过程信息网络。
3、在工艺放大过程中，气相信息的对比分析还能帮助评估不同规模下的代谢差异，为放大决策提供参考。
需要指出的是，间接表征提供的是代谢状态的总体趋势，具体判读仍需要结合工艺背景，与液相监测结果联合分析，才能获得较为完整的认识。
（六）数据完整性与合规支撑
在药品生产等受监管领域，过程数据不仅是技术工具，也是质量管理体系的组成部分。在线监测系统持续记录的数据，天然具备完整性与可追溯性，能够为批次放行、偏差调查与审计核查提供过程证据。
数据与批记录、控制系统的整合，使质量决策建立在更为充分的事实基础上，契合质量管理体系对数据可靠性的要求。对于新建或改造的生产线，将在线监测纳入整体设计，也有助于从源头建立规范的过程数据管理机制。
技术的价值需要在应用中兑现，而应用过程也暴露出若干需要正视的挑战。对这些挑战的清醒认识，是技术持续完善的前提。
（一）定量模型的建立与维护
发酵液是随时间变化的复杂体系，定量模型的建立往往需要投入大量标定工作，覆盖不同菌株、培养基批次与工艺条件，工作量大且周期较长。
1、模型在使用过程中可能面临漂移与失配的问题。当培养基配方、菌株特性或工艺参数发生变化时，原有模型可能不再适用。
2、应对思路是采用系统化的模型生命周期管理，将标定设计、模型验证、定期复核与变更评估纳入规范流程。
3、借助持续积累的过程数据，模型的可靠性与泛化能力还可以不断优化，形成良性循环。
（二）信号质量与干扰因素
发酵液中存在的荧光物质、悬浮颗粒、气泡与浊度变化，都会对拉曼信号产生干扰，影响测量的稳定性与准确性。尤其在菌体密度较高、体系较为浑浊的阶段，信号质量的控制更具挑战。
1、荧光背景会抬高基线、掩盖弱信号，需要通过激发波长选择与数据处理手段加以抑制。
2、气泡与颗粒物会造成散射波动，影响光谱的重复性，需要在探头设计与安装位置上加以考虑。
针对这些问题，工程上通过优化光学设计、加强光谱预处理等方式加以缓解。对不同发酵体系开展针对性的信号质量评估，也是方案落地前的重要环节，有助于提前识别潜在的测量难点。
同时，将信号质量指标纳入在线监控，可以在干扰加剧时及时提示，避免数据失真影响工艺判断。
（三）工程可靠性与长期运行
在线探头长期浸泡于发酵液中，可能面临表面附着、结垢、生物膜累积等问题，进而影响光路与信号稳定。探头材料的耐腐蚀性与表面处理工艺，直接关系到长期运行的可靠性。
同时，灭菌与清洗周期对探头性能的影响需要系统评估。通过合理的探头选型、安装设计与维护制度，可以在保障测量质量的同时延长设备使用寿命，降低因设备问题导致的停机风险。
长期的现场运行数据积累，也能为探头寿命评估与维护周期优化提供依据，使系统的可靠性管理从经验判断走向数据支持。
对新建发酵生产线，可以在设计阶段预留探头安装接口与配套管线，为后续引入在线监测创造条件，降低改造难度。
（四）工艺差异与模型管理
不同产品、不同菌株、不同规模的发酵工艺差异明显，一套模型或一套配置难以普遍适用，需要针对具体工艺开展个性化的开发与验证工作。
这种个性化需求意味着技术应用需要工艺知识与光谱方法学的紧密结合，对实施团队的能力提出了较高要求。分阶段推进、从小试到生产逐步验证，是降低实施风险的有效路径，也便于在早期发现并解决潜在问题。
随着在线监测方案在各工艺中的积累，可以逐步提炼共性方法，形成模块化的配置与实施流程，缩短新工艺的开发周期。
（五）投入产出与推广门槛
在线拉曼系统的引入涉及设备投入、标定建模与人员培训等多方面成本，企业需要结合自身工艺特点与质量需求，评估投入的合理性。
随着技术成熟度提高与实施经验积累，相关成本正在逐步下降，标准化程度也在提升。越来越多面向特定场景的成熟方案进入市场，为不同规模的企业提供了更灵活的选择，也为技术的规模化推广创造了有利条件。
从长远看，随着设备成本与建模成本的下降，在线监测将从大型企业的优先选择，逐步走向更多中小规模生产场景，惠及更广泛的生物制造企业。
展望未来，拉曼光谱在发酵过程监测中的应用将沿着多个方向持续深化。一是与温度、pH、溶解氧等常规过程参数的融合，构建多源数据共同驱动的过程表征体系，让光谱信息与传感信息相互补充。二是与数据驱动方法相结合，利用积累的过程数据挖掘更深层的规律，提升模型的智能水平与预测能力，使系统能够主动识别异常、提示风险。
数字孪生、过程建模等理念的兴起，也为在线监测数据提供了更广阔的应用出口。以连续、多维的过程数据为原料，可以构建更为完整的发酵过程模型，支持工艺仿真、条件寻优与故障诊断，让过程数据真正转化为工艺知识。
技术的成熟离不开产业生态的支撑。分析仪器厂商与工艺研究机构、制药企业的协同，正在推动在线监测方案从单点应用走向系统集成；相关标准的逐步建立，也将为技术评估与推广应用提供共同语言。
从小试研发到生产放大，从单一产品到多种工艺，在线拉曼技术的应用场景将持续扩展。过程分析理念的普及与工程规范的完善，也将推动这项技术从可用走向好用，为生物制造的高质量发展提供更加坚实的过程数据支撑。
从离线取样到在线原位检测，改变的不仅是检测方式本身，更是对发酵过程的认知方式与控制模式。拉曼光谱技术凭借独特的分子识别能力、无损原位的工作方式与不断成熟的工程化水平，在这一转变中扮演着日益重要的角色。
当然，定量建模、信号质量与工程可靠性等方面的挑战依然存在，技术的完善需要工艺知识与方法学研究的持续投入。可以预期，随着相关方法的不断成熟与智能化工具的持续演进，拉曼光谱技术将在发酵过程监测中发挥更加扎实的作用，为生物制造的智能化转型提供持久支撑。
