生物发酵是制药、食品、生物能源等产业的核心环节。其过程高度复杂，涉及菌体生长、底物消耗、代谢产物生成等多变量动态交互。传统依赖人工离线取样分析的方法存在显著滞后性，无法及时反映罐内真实生化状态，制约工艺优化与产品质量。因此，发展高效、精确的在线过程分析技术（PAT） 成为提升发酵产业智能化水平的关键需求。拉曼光谱仪以其独特优势，正逐步成为实现这一目标的利器。

技术原理：分子振动的“指纹”识别

拉曼光谱技术基于光与物质分子相互作用产生的非弹性散射效应。当特定波长的单色激光照射到样品时，绝大部分光子发生弹性散射（瑞利散射），但极小部分光子（约百万分之一）会与分子振动或转动能级发生能量交换，产生频率偏移的拉曼散射光。这种频率偏移（拉曼位移）与分子特定的化学键及振动模式一一对应，形成了如同“分子指纹”般的特征光谱。

在生物发酵体系中，不同组分（如葡萄糖、氨基酸、有机酸、目标蛋白、菌体本身）均具有独一无二的拉曼光谱特征。通过解析实时采集的光谱信息，即可定性、定量地获取发酵液中多种关键生化物质的浓度及其变化趋势，为过程控制提供直接依据。

在线监测系统的核心组成与部署

实现发酵过程的在线实时监测，拉曼光谱仪需整合为完整的嵌入式系统：

1.光学探头：这是系统与发酵罐的直接接口。通常采用穿透式或浸入式探头设计，具备高强度石英视窗和光学聚焦系统。探头必须满足严格的无菌要求（如CIP/SIP耐受性）、长期化学稳定性及机械强度。光纤传导设计使得核心拉曼光谱仪主机可远离恶劣的发酵罐环境。

2.激光光源与光谱仪：稳定、单色性好的激光光源（常见波长如785nm）激发样品产生拉曼信号。高性能光谱仪则负责收集、分光并探测微弱的拉曼散射光，将其转换为高分辨率、高信噪比的数字光谱数据。

3.实时数据处理与分析平台：这是系统的“大脑”。化学计量学模型（如PLS、PCA） 是核心工具。它们基于大量已知浓度的训练样本光谱数据建立，能够快速将实时采集的、可能重叠复杂的原始光谱，解析转化为各目标组分（如葡萄糖、乳酸、产物）的精确浓度值。该平台需具备实时运算、数据存储、报警及与过程控制系统通信的能力。

部署时，拉曼光谱仪探头通常通过标准接口（如法兰）无菌植入发酵罐内部或旁路流通池，确保实时获取代表性样品信息。整个系统可实现7x24小时连续运行。

在生物发酵中的关键应用场景

关键底物与营养物监控：实时追踪葡萄糖、甘油、特定氨基酸等浓度变化，避免底物过量抑制或饥饿限制生长，优化补料策略。

代谢产物与副产物分析：在线监测目标产物（如抗体、酶、抗生素）以及可能抑制生长的代谢副产物（如乳酸、乙酸、乙醇）的积累动态，及时调整工艺参数（如pH、溶氧、温度）以最大化产率。

细胞生理状态评估（间接）：通过分析特定谱带（如核酸、蛋白质、脂类的特征峰），可间接推断菌体密度、活性甚至代谢通量变化，为过程优化提供生理学依据。

过程一致性判断与终点控制：基于实时光谱数据与预设模型的比对，快速判断批次间一致性，并在产物达到目标浓度或代谢状态满足要求时，准确触发放罐指令，减少等待时间。

当前面临的挑战与应对

尽管优势显著，拉曼光谱仪在复杂发酵体系应用中也面临挑战：

荧光背景干扰：发酵液中的某些组分（如培养基成分、细胞碎片）可能产生强荧光，掩盖微弱的拉曼信号。应对策略包括优化激发波长（如选择785nm或1064nm近红外激光）、开发荧光抑制算法、以及应用表面增强拉曼（SERS）技术（虽在在线应用仍需突破）。

模型建立与维护：稳健、精确的定量模型需要大量覆盖工艺空间的代表性样本进行训练和严格验证。发酵工艺变更或菌株改良后，模型可能需重新校准或更新，对数据科学能力提出高要求。

探头污染与信号稳定性：长期运行中探头表面可能附着气泡、菌体或蛋白质，影响信号质量。这要求优化探头设计（如自清洁、防污涂层）并开发自动化的漂移校正算法。

复杂体系的光谱解析：多组分共存导致光谱重叠严重，对化学计量学模型的变量选择与算法鲁棒性提出更高要求。

未来发展趋势

随着技术进步，拉曼光谱仪在生物发酵在线监测中的应用前景广阔：

多光谱技术融合：结合近红外（NIR）、中红外（MIR）或荧光光谱，构建多维数据融合分析平台，相互印证，提供更全面的过程信息。

微型化与集成化：探头和光学系统持续小型化，更易于在大型罐体或多点位部署，实现发酵罐内不同空间位置的监测。

人工智能深度应用：结合深度学习等先进算法，提升复杂光谱的自动解析能力、模型预测精度以及对异常状态的智能诊断与早期预警能力。

高通量微型反应器监测：在微升甚至纳升级别的微型生物反应器中集成微型化拉曼光谱仪探头，加速菌种筛选与工艺开发。

结语

拉曼光谱仪凭借其非侵入、无需样品预处理、可同时监测多组分的核心优势，正在深刻变革生物发酵过程的监控模式。它成功地将传统的离线、滞后分析转变为在线、实时的过程洞察，为精确控制、效率提升和产品质量保障提供了强大支持。尽管在应对复杂体系干扰、模型普适性等方面仍需持续研究，其作为一项重要的过程分析技术，无疑将持续推动生物制造向更智能、更高效、更可控的方向发展。